PCR實(shí)驗室在操作時(shí)應注意事項

  PCR檢測微量感染因子時(shí)，容易因為污染的而導致各種問(wèn)題，因此，進(jìn)行PCR操作時(shí)，操作人員應該嚴格遵守一些操作規程，*大程度地降低可能出現的PCR污染或杜絕污染出現。

　　(1)劃分操作區：

　　目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實(shí)現完全閉管操作，但無(wú)論是否能夠達到單人單管，均要求實(shí)驗操作在三個(gè)不同的區域內進(jìn)行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區內進(jìn)行：

　?、贅吮咎幚韰^，包括：擴增摸板制備;

　?、赑CR擴增區，包括：反應液的配制和PCR擴增;

　?、郛a(chǎn)物分析區，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆制備。

　　※各工作區要具有一定隔離，操作器材專(zhuān)用，要有一定方向性，如，標本制備→PCR擴增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。

　　切記：產(chǎn)物分析區的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區。

　　(2)分裝試劑：

　　PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝，所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來(lái)吸取擴增后的DNA和其他來(lái)源DNA：

　?、貾CR用水應為高壓的雙蒸水;

　?、谝锖蚫-NTP用高壓的雙蒸水在無(wú)PCR擴增產(chǎn)物區配制;

　?、垡锖蚫-NTP應分裝儲存，分裝時(shí)應標明時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因;

　　(3)實(shí)驗操作注意事項：

　　盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。

　　因此：不僅要在進(jìn)行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節都應該注意：

　?、俅饕淮涡允痔?，若不小心濺上反應液，立即更換手套;

　?、谑褂靡淮涡晕^，嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(cháng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染;

　?、郾苊夥磻猴w濺，打開(kāi)反應管時(shí)為避免此種情況，開(kāi)蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面;

　?、懿僮鞫喾輼悠窌r(shí)，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度;

　?、?后加入反應模板，加入后蓋緊反應管;

　?、薏僮鲿r(shí)設立陰陽(yáng)性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統的可信性;

　?、弑M可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器*容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA的污染，*好使用可替換或高壓處理的加樣器。如，沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過(guò)程中加樣器應該專(zhuān)用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區;

　?、嘀貜蛯?shí)驗，驗證結果，慎下結論。

　　PCR擴增重要標準

　　什么是PCR實(shí)驗靈敏度?

　　靈敏度指的是PCR擴增反應能夠檢測到目的基因*小值。研究結果表明，影響PCR擴增效率的因素，如，模板的復雜程度與完整性、引物純度及其與模板結合效率、反應溫度、DNA聚合酶的熱穩定性與擴增性能、反應緩沖液的離子組成(主要指：陽(yáng)離子)、反應優(yōu)化劑等，均決定PCR實(shí)驗檢測靈敏度。在*佳擴增條件下，常規PCR反應能夠檢測到pg(10～12g)數量級目的基因。對于一個(gè)特定的目的基因，模板與引物通常都是已經(jīng)限定好的因素。因此，選擇什么樣的PCR反應體系(包括：DNA聚合酶與反應緩沖液等)就是研究者提高PCR實(shí)驗靈敏度的關(guān)鍵因素了。

　　與實(shí)驗室自配PCR擴增體系相比，東盛Taq Mix對反應緩沖液中的成分進(jìn)行優(yōu)化，并加入了適當比例的反應增強劑(PCR Enhancer)，提高DNA聚合酶熱穩定性，顯著(zhù)降低模板二級結構對PCR擴增性能影響，使得DNA聚合酶處于*適活性狀態(tài)，從而獲得比自配體系更高檢測靈敏度。即時(shí)反應體系中只有幾個(gè)目的基因拷貝，也能輕松檢測。

　　什么是PCR實(shí)驗特異性?

　　特異性指的是在PCR擴增過(guò)程中，專(zhuān)一性擴增目的片段而非其他片段的性能。在PCR實(shí)驗本身的靈敏度很高，且實(shí)驗條件未充分優(yōu)化的情況下，通常會(huì )在目的片段出現同時(shí)伴隨有其他雜帶，即，發(fā)生非特異性擴增現象。模板、引物性質(zhì)及質(zhì)量、反應條件控制等均會(huì )影響PCR擴增特異性。近年，研究結果表明，緩沖液品質(zhì)(如，離子種類(lèi)與組成，反應優(yōu)化劑等)對保證PCR特異性擴增起著(zhù)不可忽視的作用。一般緩沖液中調節氫鍵作用鹽只有KCl，而東盛HSTMTaq Mix的緩沖體系通過(guò)反應優(yōu)化劑以及KCl/(NH4)SO4鹽離子體系平衡調節，顯著(zhù)提高PCR擴增特異性，降低背景。

　　PCR實(shí)驗靈敏度與特異性是一對此長(cháng)彼消特性，這也決定我們實(shí)驗體系調節實(shí)際上就是需要找到適合實(shí)驗靈敏度與特異性平衡點(diǎn)。由于PCR體系中的眾多成分，使得組合較多，篩選工作繁雜。東盛基于靈敏度與特異性分別設計了PCR Mix和HS Taq Mix，幫您確定大平衡點(diǎn)，如果您需要更細致的平衡點(diǎn)，請選擇相應的Mix Kit系列進(jìn)行微調。