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發(fā)布時(shí)間:2022-12-23 09:40:52 文章作者:geermo
臨床基因擴增實(shí)驗又稱(chēng)PCR實(shí)驗,近年來(lái)對這類(lèi)實(shí)驗室的建設越來(lái)越得到重視,因為它對檢測結果的可靠性、準確性和安全性起到至關(guān)重要的作用。
一、PCR實(shí)驗室平面布局
臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室原則上分為四個(gè)單獨的工作區域:試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增反應混合物配制和擴增區、擴增產(chǎn)物分析區。為避免交叉污染,進(jìn)入各個(gè)工作區域必須嚴格遵循單一方向進(jìn)行,即只能從試劑貯存和準備區→標本制備區→擴增反應混合物配制和擴增區→擴增產(chǎn)物分析區。
各實(shí)驗區之間的試劑及樣品傳遞應通過(guò)傳遞窗進(jìn)行。
二、實(shí)驗室空調通風(fēng)系統設計及壓力控制
PCR實(shí)驗室并沒(méi)有嚴格的凈化要求,但是為避免各個(gè)實(shí)驗區域間交叉污染的可能性,宜采用全送全排的氣流組織形式。同時(shí),要嚴格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實(shí)驗區的壓力要求。
1.試劑貯存和準備區
該實(shí)驗區主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于標本制作的材料應直接運送至該區,不得經(jīng)過(guò)其他區域。試劑原材料必須貯存在本區內,并在本區內制備成所需的貯存試劑。對氣流壓力的控制,本區并沒(méi)有嚴格的要求。
2.標本制備區
該區域主要進(jìn)行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時(shí)cDNA的合成。
本區的壓力梯度要求為:相對于鄰近區域為正壓,以避免從鄰近區進(jìn)入本區的氣溶膠污染。另外,由于在操作中可能會(huì )發(fā)生氣溶膠所致的污染,所以應避免在本區內不必要的走動(dòng)。
3.擴增反應混合物配制和擴增區
該區域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴增。此外,已制備的DNA模板和合成的cDNA(來(lái)自樣本制備區) 的加入和主反應混合液(來(lái)自試劑貯存和制備區) 制備成反應混合液等也可在本區內進(jìn)行。在巢式PCR測定中,通常在**輪擴增后必須打開(kāi)反應管,因此巢式擴增有較高的污染危險性,第二次加樣必須在本區內進(jìn)行。
本區的壓力梯度要求為:相對于鄰近區域為負壓,以避免氣溶膠從本區漏出。為避免氣溶膠所致的污染,應盡量減少在本區內的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加氧等應在超凈臺內進(jìn)行。
4.擴增產(chǎn)物分析區
該區域主要進(jìn)行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動(dòng)封閉分析儀器檢測,此區域可不設。
本區是*主要的擴增產(chǎn)物污染來(lái)源,因此對本區的壓力梯度的要求為:相對于鄰近區域為負壓,以避免擴增產(chǎn)物從本區擴散至其它區域。
三、污染的預防與控制
PCR實(shí)驗室設計的核心問(wèn)題是如何避免污染。在實(shí)際工作中,常見(jiàn)的有以下幾種污染類(lèi)型:擴增產(chǎn)物的污染;天然基因組DNA的污染;試劑的污染以及標本間的污染。由于一旦發(fā)生污染,實(shí)驗就必須停止,直到找到污染源為止,而且實(shí)驗結果必須作廢,需重新進(jìn)行實(shí)驗。所以發(fā)生污染后再?lài)@實(shí)驗室來(lái)尋找污染源不但耗時(shí)而且繁瑣,浪費人力物力。因此要避免污染,首先應是預防,而不是排除。
1.工作區域的嚴格劃分
(1)各個(gè)實(shí)驗區域設置合理。
(2)各個(gè)實(shí)驗區域要有明顯的標記(如醒目的門(mén)牌或不同的地面顏色等),以避免各個(gè)不同實(shí)驗區域設備物品、試劑等發(fā)生混淆。
2.合理的系統設置
(1)合理的空調通風(fēng)系統設置,盡量采用全送全排的空調系統。
(2)嚴格的氣流壓力控制,保證不同的實(shí)驗區內不同的壓力要求。
3.規范地操作
(1)臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室的技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓,經(jīng)培訓合格后才能從事臨床基因擴增檢驗的工作。
(2)在實(shí)驗操作過(guò)程中,操作者必須戴手套,并經(jīng)常更換。此外,操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施。
(3)清潔工作及時(shí)、正確。實(shí)驗工作結束后,必須立即對本區進(jìn)行清潔。除常規的消毒液體對表面進(jìn)行擦拭消毒或紫外線(xiàn)燈的照射消毒外,對一些實(shí)驗設備還應進(jìn)行高壓消毒處理。
4.嚴格地管理
(1)嚴格控制進(jìn)出實(shí)驗室的人員。與實(shí)驗無(wú)關(guān)的人員不得隨意進(jìn)出實(shí)驗室,有條件的情況下要設置獨立的通道和進(jìn)出整個(gè)實(shí)驗區的門(mén)。
(2)在各個(gè)實(shí)驗區域使用帶有明顯區別標志的工作服(如不同顏色),當工作人員離開(kāi)時(shí)不得將本區的工作服帶至其它區域。
(3)盡量減少在實(shí)驗區內不必要的走動(dòng)以減少交叉污染的可能性。
(4)擴增產(chǎn)物分析區是*主要的擴增產(chǎn)物污染來(lái)源,廢液不能在實(shí)驗室中傾倒,必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠離實(shí)驗室的地方棄掉,用過(guò)的吸頭等一次性材料也應經(jīng)消毒液浸泡消毒后統一處理,如焚燒等。
(5)擴增產(chǎn)物分析區可能會(huì )用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì),應特別注意實(shí)驗人員的安全防護。
5.完備的實(shí)驗室配套設施
完備的實(shí)驗室配套設施是保證實(shí)驗工作的必要條件,應根據各個(gè)實(shí)驗室實(shí)驗內容的不同配備相應的設備和儀器,如超凈工作臺、離心機、加樣器等。
四、PCR實(shí)驗室建設常用標準規范
《實(shí)驗室生物安全通用要求》國家標準GB19489-2008
《臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室工作規范》衛醫發(fā)【2002】8號文
《臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室管理暫行辦法》衛醫發(fā)【2002】10號文
《臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室設計標準》衛醫發(fā)【2002】10號文附件
《基因檢驗實(shí)驗室技術(shù)要求》國家質(zhì)監檢驗總局SN/T1193-2003
《潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境-生物污染控制》國際標準ISO14698
《潔凈廠(chǎng)房設計規范》國家標準GB500732013
《潔凈室施工及驗收規范》GB50591-2010
《室內空氣質(zhì)量標準》國家標準GB/T18832002
《生物安全實(shí)驗室建筑技術(shù)規范》國家標準GB50346-2011
《病原微生物實(shí)驗室生物安全管理條例》衛生部(2004-11-12)